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http://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN 0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(7): 643–648
CN 31-1300/Q |
Mapping of FHL2
Transcription Activation Domain
YAN Jing-Hua, YE Qi-Nong*, FANG Yan, ZHU Jian-Hua, HUANG
Cui-Fen
( Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100850,
China )
Abstract FHL2, a member of LIM-only protein family, plays an important role in transcription regulation, apoptosis, cancer development and progression. In this study, a mammalian transcription activation system was constructed by using DNA binding domain(DBD) of GAL4 and luciferase reporter gene with DBD binding sequence, and used for mapping of FHL2 transcription activation domain. First, the coding sequence of GAL4-DBD was inserted into expression vector pcDNA3, generating the pDBD recombinant plasmid, then the wild-type FHL2 and its mutants were fused in-frame with GAL4-DBD, resulting in expression vectors for wild-type FHL2 and its mutants. All of the recombinant plasmids were transfected into 293T cells. Western blot assay showed that all of the fusion proteins were expressed. The analysis of FHL2 transcription activation properties by using the GAL4-luciferase reporter gene indicated that wild-type FHL2 had activation activity in both 293T and MCF-7 cells. The deletion of the half LIM domain at the N-terminus severely impaired the capacity of FHL2 to stimulate transcription. The mutant lacking the LIM domain at the C-terminus was totally inactive, while the deletion of two LIM domains at the C-terminus partially recovered its ability to stimulate transcription. The deletion of the second LIM domain at C-terminus did not alter the activation capacity of FHL2. These results suggest that the last LIM domain at the C-terminus of FHL2 is critical for its transcription activation function, the second LIM domain at the C-terminus may be a negative regulation region, but this negative regulation depends on the last LIM domain. Mapping of transcription activation domain of FHL2 lays solid basis for further study on various FHL2 functions.
Key words FHL2； transcription activation； domain； mapping
__________________________________________
Received: Feburary 24, 2003 Accepted: April 14, 2003
*Corresponding author: Tel, 010-66931830;
e-mail, [email protected]
严景华 叶棋浓* 方言 朱建华 黄翠芬
( 军事医学科学院生物工程研究所, 北京100850
)
关键词 FHL2； 转录激活； 结构域； 定位
FHL2(four and half LIM domain protein)是仅有LIM结构域的蛋白质， 属于LIM蛋白家族成员［1］。 它由四个半LIM结构域组成， 每个LIM结构域包括两个锌指结构， 这种结构提示LIM家族成员可能参与调节蛋白质之间的相互作用［2～12］。
FHL2首先是在胚横纹肌肉瘤细胞中发现的。 1997年Genini等［13］比较了正常肌细胞及横纹肌肉瘤细胞中的基因表达水平， 发现FHL2在横纹肌肉瘤细胞中表达水平下调。 同位素照射横纹肌肉瘤细胞， 内源p53 mRNA 水平升高的同时， FHL2 mRNA水平也升高。 瞬时表达p53也能刺激FHL2 mRNA水平上升。 尤其值得注意的是FHL2在肿瘤细胞中过表达能诱导细胞凋亡［14］。 这些证据表明， FHL2在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。
目前， 已发现FHL2与多种蛋白质相互作用， 这些蛋白质包括雄激素受体(AR)［15］、PIZF［16］、CDC47［17］、 衰老蛋白2(presenilin-2)［18］、 hNP220［19］、IGFBP［20］等。 FHL2在体内和体外特异地与AR相互作用， 并在核内与AR共定位。 FHL2能促进AR的转录激活功能， 协同激活AR靶基因的转录。 FHL2还能增强CREB转录激活活性［21］。 PIZF是序列特异的组蛋白乙酰化酶的共抑制子， 与染色质的重建有关。 FHL2能与PIZF相互作用增强由PIZF引起的转录抑制。 也有证据显示， FHL2参与了Rho 信号途径［22］。 由此可见， FHL2在转录调节、细胞凋亡、染色质重建等方面具有重要作用。
已有证据表明， FHL2具有转录激活功能［21］， 但FHL2中与转录激活相关区域定位的研究国内外还未见报道。 本研究建立了哺乳动物细胞转录激活检测系统， 然后对FHL2的转录激活结构域进行了定位， 为进一步研究FHL2的多种功能打下了基础。
1 材料和方法(Materials and Methods)
1.1 质粒和细胞株
pcDNA3(Invitrogen公司产品)、 pGBDT7(含有GAL4-DBD序列， Clontech公司产品)、 pACT2-FHL2质粒(从Clontech公司的酵母双杂交文库中筛选得到的一个质粒)由本室保存。 SV40转化的293T胚胎肾细胞和乳腺癌细胞株MCF-7由本室保存。
1.2 分子生物学试剂
文中所用各种分子生物学试剂分别购自NEB、Qiagen、 Vector 、Promega等公司。 抗DBD多克隆抗体购自Santa Cruz公司。 辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG购自Vector公司。
1.3 重组质粒的构建
首先构建含有GAL4-DBD序列的重组质粒。 以pGBDT7为模板， 用P1(5′-CCCAAGCTTACCATGAAGCTACTGTCTTCTATC-3′和P2(5′-CGGGATCCGGTACCCAGGTCCTCCTCTGAGAT-3′) 引物PCR扩增GAL4-DBD片段， 双酶切(HindIII和BamHI)pcDNA3载体和PCR产物， 再将PCR产物插入到双酶切载体中， 即得到重组质粒pDBD。 其次构建与GAL4-DBD融合的野生型FHL2及其不同突变体表达载体。 以pACT2-FHL2为模板， 用P3(5′-CGGGATCCATGACTGAGCGCTTTGACTGC-3′)和P4(5′-CCGCTCGAGTCAGATGTCTTTCCCACAGTC-3′)引物PCR扩增编码279个氨基酸的野生型FHL2 cDNA序列； 用P5(5′-CGGGATCCTTCGCCAACACCTGCGAGGAG-3′)和P6(5′-CCGCTCGAGTCAGATGTCTTTCCCACAGTC-3′ )引物扩增编码36～279氨基酸残基间的FHL2 cDNA序列； 用P3和P7(5′-CGCTCGAGTCACAAGTCACAGAAGCAGTTCAG-3′)引物扩增编码1～216氨基酸残基间的FHL2 cDNA序列； 用P3和P8(5′-CCGCTCGAGTCATTGTTTCTCATAGCAGGGCAC-3′)引物扩增编码1～157氨基酸残基间的FHL2 cDNA序列； 利用重组PCR技术， 构建缺失157～216位氨基酸残基突变体， 即以pACT2-FHL2为模板， 先用P3和P9(5′-CCAGCACACTTCTTGGCATATTGTTTCTCATAGCA-GGGCAC-3′) 引物扩增编码1～157氨基酸残基间的FHL2 cDNA序列， 用P10(5′-GTGCCCTGCTAT-GAGAAACAATATGCCAAGAAGTGTGCTGG-3′)和P4引物扩增编码216～279氨基酸残基间的FHL2 cDNA序列， 再用上述两个PCR片段等摩尔混合物为模板， 用P3和P4引物PCR扩增编码缺失157～216位氨基酸残基的FHL2 cDNA序列。 扩增参数为： 94 ℃变性1 min后， 按以下参数进行25个循环： 94 ℃变性1 min， 55 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1.5 min。 最后72 ℃再延伸7 min。 然后将各PCR产物分别克隆到经BamHI酶切的pDBD载体中， 各重组质粒分别命名为pDBD-FHL2、pDBD-FHL2(△1-36) 、pDBD-FHL2 (△216-279)、pDBD-FHL2(△157-279)和 pDBD-FHL2 (△157-216)。
1.4 细胞转染
293T肾细胞用RPMI 1640培养基培养， 乳腺癌细胞株MCF-7用DMEM培养基培养， 两种培养基均含有10%的小牛血清和双抗。 在转染前24 h用不含双抗、含10%小牛血清的相应培养基将细胞接种在12孔板中(Costar公司产品)， 接种量以转染时细胞密度达到90%为准。 将总量为0.5 μg的DNA用80 μl不含双抗和血清的培养基稀释， 再用80 μl相同的培养基稀释2.5 μl Lipofect-AMINE2000， 立即将二者混合， 室温放置20 min后， 加入到含有0.8 ml培养基和10%小牛血清的12孔板中， 24 h后收获细胞。
1.5 Western印迹分析
将重组质粒转染293T细胞， 按常规方法收集细胞后， 加入适量RIPA缓冲液， 超声破碎， 离心(12 000 r/min、 10 min、 4 ℃)， 收集上清液。 样品经SDS-PAGE后， 电转移至硝酸纤维素膜上， 50 g/L脱脂奶粉封闭过夜， 加入抗GAL4-DBD多克隆抗体， 结合1 h， TBST洗膜3次， 每次7 min， 再加入辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔 IgG， 室温结合1 h， TBST洗膜3次， 每次7 min， 用化学发光法显色5 min， X光片压片显影。
1.6 荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性测定
基本按Promega公司提供的试剂盒说明进行。 细胞转染24 h后， 弃去培养基， 再用PBS洗细胞1次， 加入160 μl裂解缓冲液， 放在水平摇床上摇动15 min， 用细胞刮子刮下细胞， 放入1.5 ml离心管中， 旋涡振动5 min， 离心(12 000 r/min、 10 min、 4 ℃)， 取上清液测定荧光素酶活性。
用ONPG测定β-半乳糖苷酶活性。 取上述上清液10 μl加入到450 μl含有β-巯基乙醇(2.7 ml/L)的Z缓冲液中， 加入100 μl 0.4%的ONPG溶液， 37 ℃保温， 直到出现浅黄色为止， 加入250 μl 1 mol/L Na2CO3终止反应， 测定样品A420值。
1.7 转录激活活性检测
重组蛋白质转录激活活性即为它们对GAL4-LUC报告基因的转录激活能力。 在每一转染实验中， 同时转染上述构建的重组质粒、 GAL4-LUC报告基因质粒和表达β-半乳糖苷酶的质粒。 重组蛋白质转录激活活性即为同一孔中荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性比值。 β-半乳糖苷酶起着校正细胞转染效率的作用。
2 结果(Results)
2.1 用于转录激活活性检测的pDBD重组质粒的构建
根据已有文献构建哺乳动物细胞中转录激活活性检测系统， 其基本原理是将待测蛋白质与GAL4转录因子的DNA结合结构域(DBD)融合， 该融合蛋白通过GAL4-DBD能与荧光素酶报告基因(GAL4-LUC)上游调控序列结合， 若待测蛋白质具有转录激活活性， 则荧光素酶基因被激活， 反之， 则否。 因此， 按材料和方法中所述构建表达GAL4-DBD的重组质粒pDBD。 酶切鉴定该重组质粒， 得到了长约550 bp左右、与预期大小相同的外源基因插入片段(图1)， 说明克隆已经成功。
Fig.1 Restriction analysis of recombinant plasmid pDBD
M, DNA marker; 1, pcDNA3 vector digested with HindIII and BamHI; 2, pDBD recombinant plasmid digested with HindIII and BamHI.
2.2 含各种FHL2片段的重组质粒的构建
按材料和方法中所述构建表达野生型FHL2及其突变体重组质粒pDBD-FHL2、pDBD-FHL2(△1-36)、 pDBD-FHL2 (△216-279)、和pDBD-FHL2(△157-279)。 用BamHI和EcoRV酶切鉴定这些重组质粒， 分别得到了长约840 bp、730 bp、650 bp和480 bp的与预期大小相同的外源基因插入片段［图2(A)］。 pDBD-FHL2 (△157-216)质粒切出的目的片段大小约为660 bp［图2(B)］。 所有突变体都进行了核苷酸序列分析， pDBD-FHL2(△1-36)测序引物为5′-CATCATCATCGGAAGAGAG-3′， pDBD-FHL2 (△216-279)、 pDBD-FHL2(△157-279)和pDBD-FHL2 (△157-216)的测序引物为SP6通用引物， 测序结果证明构建的突变体核苷酸序列是正确的(图略)。
Fig.2 Restriction analysis of wild-type FHL2 and its mutant recombinant
plasmids
All of the recombinant plasmid digested with BamHI and EcoRV. (A) M, DNA marker; 1, pDBD vector; 2, pDBD-FHL2; 3, pDBD-FHL2(△1-36); 4, pDBD-FHL2(△216-279); 5, pDBD-FHL2(△157-279). (B) M, DNA marker; 1, pDBD vector; 2, pDBD-FHL2(△157-216).
2.3 野生型FHL2及其突变体在哺乳动物细胞中的表达
将重组质粒pDBD、pDBD-FHL2、pDBD-FHL2(△1-36)、pDBD-FHL2 (△216-279)和pDBD-FHL2(△157-279)分别转染293T细胞， 用抗GAL4-DBD抗体进行Western 印迹分析， pDBD在真核细胞中正确表达了分子量约20 kD的GAL4-DBD［图3(B)］。 pDBD-FHL2、pDBD-FHL2(△1-36) 、pDBD-FHL2(△216-279)和pDBD-FHL2(△157-279)分别表达了分子量约为50 kD、46 kD、43 kD和37 kD的GAL4-DBD融合蛋白， 与预期结果一致， pDBD-FHL2 (△157-216)重组质粒表达了分子量约为43 kD融合蛋白［图3(C)］。 这说明FHL2各片段都按正确读框克隆并成功表达。
Fig.3 Structure and expression of FHL2 variants
(A) Structure of FHL2 variants. (B) and (C)
Western blot assay. All of the recombinants (0.2 μg) were transfected into 293T
cells. After 24 h, cells were harvested and Western blot was performed using
anti-DBD antibody. M, pre-staining protein marker; 1, DBD; 2, DBD-FHL2; 3,
DBD-FHL2(△1-36); 4, DBD-FHL2(△216-279); 5, DBD-FHL2(△157-279); 6,
DBD-FHL2(△157-216).
2.4 FHL2转录激活活性的定位
野生型FHL2及其缺失突变体重组质粒瞬时转染293T细胞， 与阴性对照pDBD空载体相比， 野生型FHL2使GAL4-LUC活性提高了7.7倍［图3(A)］， 缺失N端36个氨基酸(半个LIM结构域)使FHL2转录激活活性降低为4.6倍， C末端缺失一个LIM结构域则使FHL2的转录激活功能完全丧失， 而C末端缺失2个LIM结构域使FHL2转录激活活性又有所恢复(转录激活活性为对照的3.9倍)。 提示C末端缺失第二个LIM结构域可能具有抑制作用。 为证实这一点， 我们检测了单独缺失这个LIM结构域的FHL2突变体转录激活活性。 结果表明， 此突变体转录激活活性与野生型相似。
为进一步确定FHL2转录激活结构域功能的普遍性， 我们又将野生型FHL2及其缺失突变体重组质粒瞬时转染乳腺癌细胞MCF-7， 各重组蛋白质转录激活活性变化趋势与在293T细胞中完全相同［图4(B)］。 野生型FHL2转录激活活性是阴性对照的4.8 倍， pDBD-FHL2(△1-36) 、pDBD-FHL2(△216-279)和pDBD-FHL2(△157-279)转录激活活性分别为阴性对照的1.5倍、0.82倍和2.4倍， 说明FHL2转录激活结构域具有功能普遍性。
Fig.4 Transcription activating properties of different domains of FHL2
(A) Transcription activating properties of different domains of FHL2 in
293T cells. 0.2 μg pGAL4-DBD (1)， pDBD-FHL2 (2)，pDBD-FHL2(△1-36) (3)， pDBD-FHL2(△216-279) (4) or pDBD-FHL2(△157-279) (5),
pDBD-FHL2(△157-216) (6). 0.2 μg reporter plasmid and 0.1 μg β-gal expression
plasmid were transfected into 293T cells. After 24 h, cells were harvested and
luciferase and β-gal activaty were analyzed. (B) Transcription activating
properties of different domains of FHL2 in MCF-7 cells. Cells were transfected and
analyzed as mentioned above.
3 讨论(Discussion)
转录因子在细胞的生命活动过程中起重要作用。 FHL2最初被认为是一个组织特异性蛋白质， 在心肌组织中高表达［12， 23］， 但后来发现它在卵巢、乳腺和前列腺等组织中也有表达［2］。 在CV-1和HL-1细胞中， FHL2具有转录激活活性， 但目前还不清楚FHL2是否是一典型的转录因子， 因为与它结合的特异性DNA序列还没有找到。 为进一步研究FHL2转录调节功能， 我们成功建立了哺乳动物细胞转录激活活性检测系统， 并用该系统对FHL2的转录激活活性区进行了定位。 从结果看(图4)， C末端的最后一个LIM结构域是FHL2发挥转录激活功能所必需的， 该结构域的缺失可使FHL2转录功能完全丧失； 而缺失N端半个LIM结构域和缺失C端2个LIM结构域均使FHL2转录激活活性下降， 这些突变体转录激活功能的下降甚至丧失不是由于其蛋白质表达量比野生型FHL2表达量低而引起的， 相反， 这些缺失突变体蛋白质表达量明显高于野生型FHL2的表达量(图3)。 C末端第二个LIM结构域可能对FHL2转录激活具有负调控作用， 因为与C末端缺失1个LIM结构域相比， 缺失2个LIM结构域的FHL2转录激活活性有所恢复。 为进一步了解C末端第二个LIM结构域在FHL2转录激活中的作用， 我们又构建了仅缺失该结构域的突变体［图2(B)， 图3(C)］。 结果显示， 缺失该结构域突变体的转录活性与野生型FHL2相当［图3(C)］。 这表明C末端第二个LIM结构域的负调控作用取决于C末端的最后一个LIM结构域是否存在时， 当C末端最后一个LIM结构域存在时， 没有这种负调控作用， 当C末端最后一个LIM结构域不存在， 这种负调控作用便存在。 自然界中是否存在缺失C末端最后一个LIM结构域的突变体还有待进一步研究。
FHL2是较早发现的仅有LIM结构域的蛋白质， 另外发现的仅有LIM结构域的蛋白质还有FHL1［23］、FHL3［24］、FHL4［25］及ACT。 这些蛋白质成员之间有着极高的同源性， 但其转录激活功能有着较大差异。 在酵母细胞中， FHL3和ACT转录活性最高。 FHL2转录活性只有ACT的 1/10， 与FHL4相近［9］。 这表明它们的转录激活活性依赖于同一分子中LIM结构域之间彼此相互协调。 在ACT中， C末端第二个LIM结构域是主要的转录激活结构域， 而在FHL2中， C末端第二个LIM结构域具有负调控作用， 这种功能差异可以用这两个蛋白质的C末端第二个LIM结构域间的同源性最小来解释。
FHL2从一开始发现就与肿瘤有着密切的关系， FHL2在人横纹肌肉瘤中表达水平下调以及促进细胞凋亡的事实， 被认为FHL2可能是肿瘤抑制因子的重要证据。 FHL2是雄激素依赖的AR共激活子， 鉴于AR在雄激素依赖的肿瘤形成和发展中的重要作用， FHL2在这方面的功能也将更受关注。 虽然人们认为FHL2可能是一肿瘤抑制因子， 但FHL2在肿瘤中是否存在突变还有待进一步研究， FHL2的转录激活功能在肿瘤发生发展中的作用还有待进一步阐明。
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